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        小鼠耳蝸中三個Atoh1增強子協同調控聽覺毛細胞的發育

        發布時間:2022-08-05

          20228 月 5日,《PNAS》期刊在線發表了題為《三個不同的Atoh1增強子協同調控聲音受體毛細胞發育》的研究論文,該研究由中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心(神經科學研究所)、神經科學國家重點實驗室、上海腦科學與類腦研究中心劉志勇研究組與中國科學院遺傳與發育生物學研究所、分子發育生物學國家重點實驗室陸發隆研究組合作完成。該研究解析了新生小鼠耳蝸毛細胞的全基因組開放染色質圖譜,發現和驗證了兩個之前未知的Atoh1增強子。研究人員利用CRISPR/Cas9技術敲除單個或同時敲除多個Atoh1增強子,揭示了Atoh1的三個增強子以劑量依賴性協同調控毛細胞發育。該項研究結果為Atoh1表達的精準表觀遺傳學調控機制提供了更深入的理論依據,并為耳蝸毛細胞再生提供了新的潛在靶點。 

          耳蝸毛細胞是聲音的感受器,轉錄因子Atoh1突變小鼠完全喪失毛細胞,相反,過表達Atoh1能夠額外產生更多的毛細胞。Atoh1的重要生物學功能使之成為毛細胞發育再生領域的一個重要的靶點。因此,深入理解Atoh1表達的調控機制有著重要的科學意義。Atoh1在毛細胞發育過程中高度動態變化,但其精準調控機制仍知之甚少。過去20年來,Atoh1增強子1Eh1)一直被認為對Atoh1的表達至關重要。但這個假說一直并未得到體內實驗的證實,而且毛細胞中是否還存在尚未發現的其他Atoh1增強子也未可知。 

          研究人員首先利用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除Eh1,Eh1 -/- 小鼠耳蝸毛細胞發育完全正常,這表明Eh1對于毛細胞的發育不是必需的。這個結果和預期的完全相反,提示毛細胞還存在尚未發現的其他Atoh1增強子。隨后,研究人員流式分選獲得新生小鼠耳蝸毛細胞(圖1A),并利用染色質開放性測序技術(ATAC-seq),建立了毛細胞的全基因組染色質開放圖譜,發現了兩個位于Atoh1遠端的新增強子(Eh2Eh3)。而且,Eh2Eh3只在毛細胞中開放,而在對照組(小腦顆粒細胞前體細胞,同樣表達Atoh1)中處于關閉狀態,提示Eh2Eh3是毛細胞特異的調控元件(圖1B)。隨后研究人員構建了轉基因小鼠,驗證了Eh2Eh3特異在毛細胞中活躍的增強子(圖1C)。為了進一步探究Eh2Eh3在毛細胞發育中的功能,研究人員在小鼠中分別敲除Eh2Eh3,毛細胞發育完全正?;蛘邇H有弱的發育異常。但是同時敲除Eh2Eh3,毛細胞數量明顯減少;進一步發現,同時敲除三個Atoh1增強子使毛細胞數量進一步下降到最低點。正常的耳蝸毛細胞數量約2800個(圖1D),敲除Atoh1的三個增強子后,毛細胞數量急劇減少到約86個(圖1E),以上實驗結果表明Atoh1的三個增強子協同調控毛細胞的形成。  

          1 耳蝸毛細胞ATAC-seq,增強子驗證和功能分析。(A)耳蝸毛細胞流式分選和ATAC-seq示意圖。(BEh2Eh3在毛細胞中保持開放,而在對照組中處于關閉狀態。(C)轉基因小鼠耳蝸染色分析發現Eh3特異驅動毛細胞中EGFP報告基因的表達。(D)正常野生型耳蝸毛細胞。(E)同時敲除Atoh1的三個增強子引起毛細胞數量急劇減少。 

          最后,研究人員利用CUT&RUN技術,揭示了Atoh1蛋白在耳蝸毛細胞中的全基因組結合位點,發現Atoh1可以直接結合到Eh1,Eh2Eh3這三個增強子上,從而調控Atoh1自身的表達(圖2)。這個結果提供Atoh1的三個增強子被敲除后,Atoh1表達水平顯著下降,引起毛細胞數量急劇減少的分子機制。這個研究結果為在成年耳蝸支持細胞內如何重新啟動Atoh1的表達提供了理論指導,有助于促進未來成年耳蝸毛細胞再生恢復的研究。 

         

          2 Atoh1和三個增強子的調控示意圖。在正常毛細胞中,Atoh1蛋白可以直接結合到三個增強子(Eh1,Eh2Eh3)上,進而促進Atoh1自身的表達。三個增強子被同時敲除,失去了自主調控作用,引起Atoh1表達下降,毛細胞數量減少。 

          中科院腦智卓越中心劉志勇研究員和中科院遺傳發育所陸發隆研究員為該論文的共同通訊作者;腦智卓越中心博士研究生羅正南和遺傳發育所博士研究生杜毅為該論文共同第一作者,腦智卓越中心博士研究生李書亭,張迪,王廣琴,張赫博士和工作人員賀順姬對課題做出了重要貢獻,遺傳發育所舒慕婭博士也給予了重要幫助。該研究得到了中科院腦智卓越中心分子細胞技術平臺,光學成像平臺以及實驗動物平臺(實驗鼠房)的大力支持。該研究得到科技部,中科院,基金委和上海市的支持。

         

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