CRISPR-Cas13是一類由RNA介導的靶向RNA的基因編輯技術。Cas13蛋白屬于2類VI型多結構域單一蛋白RNA內切酶，許多體外研究表明Cas13蛋白激活后不僅具有切割靶RNA的功能，還能對其周圍的任意RNA（bystander RNA）進行非特異性地切割，這一特性也被用于開發RNA檢測。自2015年報道Cas13a(c2c2)以來，國內外報道了一批CRISPR-Cas13系統（Cas13b/c/d/X/Y/bt），并證明了其可以在哺乳動物細胞中對靶RNA進行高效且特異性地敲低。相較于Cas9介導的DNA編輯技術，基于Cas13的RNA編輯工具靶向動態轉錄的RNA，不會對基因組造成永久性改變，而且可以通過劑量調整等方式控制RNA編輯效果，具有可逆性，相對來說更安全。

　　然而，越來越多的證據表明Cas13a、Cas13b、Cas13d等在哺乳動物細胞中普遍存在著旁切活性（collateral activity），會造成嚴重的脫靶效應。最新的研究也表明Cas13（特別是Cas13d）對動物細胞和個體產生都會造成很大的毒副作用。所以，Cas13蛋白本身普遍存在的旁切活性已成為其走向臨床應用的最大障礙，如何降低或消除Cas13蛋白的旁切活性顯得尤為必要，開發更特異的高保真Cas13蛋白對基于RNA編輯的基因治療策略研發及后續的臨床轉化具有重要意義。

　　2022年8月11日，《Nature Biotechnology》期刊在線發表了題為“High-fidelity Cas13 variants for targeted RNA degradation with minimal collateral effects”的研究論文，該研究由中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心（神經科學研究所）、神經科學國家重點實驗室、中國科學院靈長類神經生物學重點實驗室、上海腦科學與類腦研究中心楊輝研究組和輝大（上海）生物科技有限公司研發團隊合作完成。該研究綜合利用蛋白質工程、流式細胞術、體外切割實驗、全轉錄組測序、轉基因小鼠、在體基因治療安全性驗證等技術手段，對Cas13（包括Cas13d和Cas13X）進行蛋白工程化改造、篩選及驗證，開發出了具有高效編輯活性但極低旁切活性的高保真Cas13蛋白變體。本研究對基于RNA編輯的基礎科學研究、基因治療策略研發以及后續的臨床轉化具有重要意義。

　　研究人員開發了基于綠色熒光蛋白（EGFP）和紅色熒光蛋白（mCherry）的雙熒光報告系統，用于在哺乳動物細胞中檢測Cas13蛋白的旁切效應。通過靶向敲低一種熒光蛋白（如mCherry）的mRNA，檢測另外一種熒光蛋白（如EGFP）的表達水平，研究人員發現Cas13a與Cas13d蛋白的激活都能誘導出非常顯著的旁切效應。為了降低或消除Cas13d蛋白的旁切活性，研究人員預測并對比分析了Cas13d的蛋白結構。目前已報道的Cas13家族成員均帶有2個標志性的HEPN結構域，其上的RxxxxH保守基序是Cas13核酸酶催化活性位點。當Cas13蛋白與gRNA結合其核酸酶活性被激活后，該催化活性位點會暴露在蛋白表面，繼而對周圍的RNA進行無差別的切割。

　　圖1：高保真Cas13蛋白的工程化設計、篩選及脫靶效應驗證 

　　研究人員利用蛋白質工程手段對Cas13d蛋白進行一系列的突變改造，以改變Cas13d蛋白與非靶RNA的相互作用，并綜合利用哺乳動物細胞轉染、流式細胞術等方法，篩選獲得了一些具有高效編輯活性但旁切活性顯著降低的Cas13d蛋白變體，其中Cas13d-N2V8變體綜合表現出最好的特異性，具有最高保真性（high-fidelity Cas13d，hfCas13d）。通過對大量內源基因位點進行RNA敲低的實驗，hfCas13d表現出與野生型Cas13d同樣的高活性。結合體外切割實驗、全轉錄組分析、穩轉細胞系、轉基因小鼠、在體靶向RNA敲降等技術，對hfCas13d進行了系統性的脫靶效應驗證及安全評估。綜合而言，此項工作開發出了具有高效編輯活性但極低旁切活性的高保真Cas13d蛋白變體，這一新工具顯示出更高特異性，而且在基因治療方面具有更好的安全性。 

　　圖2：高保真Cas13蛋白在哺乳動物細胞及個體中有效性及安全性的評估 

　　值得一提的是，2021年，楊輝研究組在《Nature Methods》上報道了目前最小的RNA編輯工具Cas13X系統（僅775個氨基酸），本項工作在此基礎上進一步開發出了具有高效編輯活性但極低旁切活性的高保真Cas13X蛋白變體（hfCas13X），其將在基于RNA編輯的基因治療領域顯示出非常大的應用潛力。 

　　中科院腦智卓越中心博士研究生黃佳、肖慶全，博士后賀冰冰、董雪，劉元花副研究員和輝大（上海）生物科技有限公司技術開發部童華威博士為共同第一作者，楊輝研究組的博士后汪子康、碩士研究生韓鼎毅和博士研究生王旭晨等成員積極參與課題做出了重要貢獻。本工作獲得國家基金委、科技部、上海市、中科院和臨港實驗室的資助。